vse-zabolevaniya.ru Запись к врачу в Москве
ГлавнаяАнализыМикроскопический метод

Микроскопический метод


Микроскопические исследования проводят с помощью микроскопа, который позволяет изучать невидимые глазом объекты. Этот метод используют для исследования клеточного состава биологических жидкостей пациента (крови, мочи, спермы, ликвора, желчи), кала, а также соскобов и срезов тканей, применим он и в микробиологии для исследования микроорганизмов и паразитов.
История изобретения микроскопа связана с развитием оптики. Способность прозрачных предметов с изогнутыми поверхностями (линз) изменять размеры изображения была известна человечеству давно (приблизительно еще за 300 лет до н. э). Именно эти свойства и привели к изобретению луп и очков. В 1595 г. голландец 3. Янсен изобрел первый оптический прибор, который представлял собой полую трубку с двумя линзами и увеличивал изображение в 3-10 раз. В 1609 г. итальянец Г. Галилей усовершенствовал этот прибор: сделал возможным изменять расстояние между линзами и таким образом добиваться более четкого изображения.
Слово «микроскоп» появилось в 1625 г. благодаря итальянцу И. Фаберу и уже в 1665 г. прибор, который им обозначается позволил англичанину Р. Гуку сделать научное открытие - впервые была описана растительная клетка. В конце XVII в. голландец А. Левенгук увидел с помощью микроскопа микроорганизмы в капле воды.
По мере изучения свойств света и развития оптической техники, микроскопы совершенствовались. Это позволяло детально изучать строение тканей живых макро- (в том числе человека) и микроорганизмов (бактерий, простейших, вирусов, грибков и др.). Бурное развитие микроскопии началось в конце XIX в.
Создание в 1926 г. немецким физиком X. Бушем линзы с магнитными свойствами привело в дальнейшем к изобретению электронного микроскопа в 40-х гг. XX в.
Главной характеристикой микроскопа является разрешающая способность. Чем она больше, тем лучше качество получаемого изображения. Человек способен различить точки, расстояние между которыми не менее 0,08 мм, следовательно, объекты менее 0,08 мм человеческий глаз вообще не замечает. Световой микроскоп позволяет увидеть мелкие объекты, расстояние между которыми колеблется от 0,08 мм до 0,2 мкм, а с помощью электронного микроскопа можно рассмотреть объекты, размеры которых составляют 0,1-0,01 нм.

Световая микроскопия

Классический микроскоп представляет собой штатив с подвижным тубусодержателем, осветителем и предметным столиком. Прикрепленный к ним тубус (полая трубка) оснащен системой линз. К предметному столику снизу прикреплено зеркало. Изменяя положение осветителя, зеркала и рабочей поверхности предметного столика с помощью специальных вентилей, можно добиться точной фокусировки световых лучей на исследуемом объекте и появления отчетливого изображения в объективе. На нижнем конце тубуса имеются 2-3 подвижных объектива с разной степенью увеличения, на верхнем конце - окуляр. Исследование начинают с использования объектива с меньшим увеличением и более широким полем зрения. Затем при необходимости приступают к более детальному изучению материала от больного.
Для проведения световой микроскопии биологический материал предварительно фиксируют на предметном стекле и окрашивают. Во время фиксации происходит разрушение некоторых внутренних структур клеток, причем окрашиванию подвергаются только убитые клетки, поскольку в живых краска скапливается в вакуолях и другие клеточные структуры остаются незаметными. Использование дополнительных приспособлений (темнопольного конденсора) позволяет изучать и неизмененные (живые) клетки.
В зависимости от исследуемого материала меняют направление освещения, чтобы получить изображение в окуляре.
Метод светлого поля в проходящем свете. Используют для микроскопии прозрачных и неоднородных по структуре объектов. Освещение направлено на исследуемый объект снизу, световые лучи проходят сквозь прозрачную среду и поглощаются в местах большей плотности. Чтобы изображение было более контрастным, материал для исследования предварительно окрашивают.
Метод косого освещения. Используют для исследования прозрачных объектов. Сам метод подразумевает исследование объекта в свете, падающем под большим углом. При этом можно выявить особенности поверхности объекта (рельефность, контуры).
Метод темного поля. Освещение направлено на исследуемый прозрачный объект таким образом, что проходящие через него лучи собираются вместе и не попадают в объектив, благодаря чему получается светлое изображение на темном фоне.
Световая микроскопия подразделяется на фазовоконтрастную, интерференционную, поляризационную, люминесцентную, инфракрасную, стереоскопическую и основана на использовании различных свойств света и изучаемого объекта (прозрачный или непрозрачный). Свойства исследуемого объекта (материала от пациента) влияют на направленность и характеристики отраженного света: длина световой волны и амплитуда ее колебания, направление. В результате исследуемый объект приобретает определенные яркость и цвет.
Фазово-контрастная микроскопия
С помощью фазово-контрастной микроскопии исследуют живые и не подвергшиеся окрашиванию биологические материалы (срезы тканей живого организма). Этот способ основан на свойствах луча отклоняться от исследуемого материала под разным углом в зависимости от его свойств. При этом происходит изменение длины световой волны и ее фазы.
Если микроскопии подвергаются живые или фиксированные, но не окрашенные объекты, т. е. прозрачные, то цвет светового луча при отражении почти не изменяется, а угол отклонения изменяется. При отражении света меняются и его свойства. Если разность между длиной волны направленного на исследуемый объект и отраженного света составляет одну четверть или более, то исследуемый объект видится темным на светлом фоне.
Вариантом фазово-контрастного микроскопического исследования является амплитудно-контрастное (аноптральное) исследование, проводимое с применением специального объектива, позволяющего изменять только яркость и цвет направленного на изучаемый объект света (фона). Таким образом, можно определить контуры клеток, их размеры и число.
Интерференционная микроскопия
Интерференционную микроскопию также используют для исследования живых и неокрашенных объектов. Этот способ позволяет изучать внутреннее строение клеток и основывается на раздвоении светового луча в микроскопе при прохождении через клетку с включенными в нее структурами (ядрами, вакуолями и др.). В окуляре микроскопа световые лучи соединяются, образуя свет с другими свойствами (изменяется амплитуда колебания световой волны).
Большинство клеток организма человека имеют размеры 30-50 мкм. Самые крупные клетки - это яйцеклетки (150 мкм), а самые маленькие - сперматозоиды (3-5 мкм) и эритроциты (в среднем 7,5 мкм).
С помощью определения длины волны полученного света можно установить наличие определенных структур в клетке. Так, последовательно устанавливая изменения свойств света, можно узнать толщину клетки, содержание в ней воды и сухого остатка, белков. Это исследование позволяет определить проницаемость мембраны и изменение веществ в клетке.
Поляризационная микроскопия
При поляризационной микроскопии объект исследуют в перпендикулярно направленных световых лучах, т.е. в поляризованном свете. При прохождении через неоднородные клеточные структуры и отражении свойства поляризованного света становятся иными. Изменяются его направление (вдоль поперечной или продольной оси исследуемого объекта) и скорость распространения. В зависимости от этих характеристик можно определить наличие тех или иных структур в клетке. Исследованию подвергаются и окрашенные, и неокрашенные материалы от пациента.
Поляризационная микроскопия необходима для изучения строения тканей, выявления патологических изменений и болезнетворных микроорганизмов в клетках.
Люминисцентная микроскопия
Люминисцентный способ микроскопии позволяет выявить свечение некоторых объектов в ультрафиолетовых лучах и определить наличие в исследуемом материале белков, ферментов, определенных витаминов и лекарственных веществ. Некоторые вещества начинают светиться в ультрафиолетовых лучах при добавлении красителей (флюорохромов). При этом красящее вещество может равномерно распределяться по клетке или концентрироваться только в определенных структурах.
С помощью этого исследования можно изучить не только структуру клетки, но и частично ее химический состав. Исследуя срезы тканей таким образом, можно определить, например, амилоидоз, инфаркт, опухоли. Люминисцентные микроскопические исследования используют и в иммунологии.
Инфракрасная микроскопия
Инфракрасная микроскопия основана на способности непрозрачных в видимом и ультрафиолетовом свете объектов поглощать свет с длиной волны 750-1200 нм, при этом химической подготовки исследуемый материал не требует. Инфракрасную микроскопию используют для исследования нервной ткани и в офтальмологии.
Стереоскопическая микроскопия
Стереоскопические исследования проводят с помощью специальных микроскопов, которые позволяют видеть объект под разными углами, с небольшим увеличением размеров исследуемого непрозрачного объекта.
Этот метод нашел свое применение в исследованиях тканей, взятых у больного при биопсии, операции, и особенно широко используется в судебной медицине.

Электронная микроскопия

Исследование внутриклеточных структур тканей человеческого организма и микроорганизмов проводят с помощью электронного микроскопа, который обладает высокой способностью увеличивать исследуемые объекты. Вместо светового луча на них направляют поток электронов, который поглощается с образованием электромагнитного поля или отражается. В результате на экране можно увидеть изображение исследуемого объекта, при этом в первом случае получается плоское изображение, во втором - объемное. В ходе исследования определяют форму, размер объекта и его поверхность.
Материал для исследования предварительно подвергают химической обработке: обезвоживают и заливают смолами. Затем делают очень тонкие срезы тканей, полученных с помощью стеклянных или алмазных ножей. Срезы фиксируют на предметном стекле и окрашивают.